中华人民共和国国家标准

食品卫生微生物学检验 GB 4789.14-94

蜡样芽胞杆菌检验

代替GB 4789.14-84

Microbiological examination of food hygiene

Examination of Bacillus cereus

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1 主题内容与适用范围

本标准规定了蜡样芽胞杆菌的检验方法。

本标准适用于食品和食物中毒样品中蜡样芽胞杆菌的检验。

2 引用标准

GB 4789.2 食品卫生微生物学检验菌落总数测定

GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3 设备和材料

3.1 温箱:36±1℃。

3.2 普通冰箱。

3.3 显微镜。

3.4 恒温水浴 46±1℃。

3.5 天平。

3.6 电炉。

3.7 吸管:1mL,10mL。

3.8 载玻片。

3.9 均质器或乳钵。

3.10 L型涂布棒。

3.11 灭菌刀,剪,镊子。

3.12 三角瓶:容量500mL。

4 培养基和试剂

4.1 肉浸液肉汤培养基:GB 4789.28中4.1。

4.2 酪蛋白琼脂培养基:GB 4789.28中4.65。

4.3 动力-硝酸盐培养基:GB 4789.28中4.72。

4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水:GB 4789.28中3.4。

4.5 血琼脂培养基:GB 4789.28中4.6。

4.6 3%过氧化氢溶液。

4.7 甲萘胺-乙酸溶液。

4.8 对氨基苯磺酸-乙酸溶液。

4.9 革兰氏染色液:GB 4789.28中2.2。

4.10 甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基:GB 4789.28中4.64。

4.11 0.5%碱性复红染色液:GB 4789.28中2.8。

4.12 木糖-明胶培养基:GB 4789.28中4.66。

5 检验程序

蜡样芽胞杆菌检验如下:

┌───────────┐

│ 检样 │

│25g(ml)加225ml生理盐水│

└─────┬─────┘

┌─────┴──────┐

│做成10-1--10-5的稀释液 │

└┬────────┬──┘

┌─────┴┐ ┌──┴───┐

│选择性培养基│ │选择性培养基│

│（菌数测定）│ │ (分离培养) │

│ MYP │ │ MYP │

└──────┘ └──┬───┘

　　　　　　　　 ┌──────┴┐

┌────┤营养琼脂培养基├┬─────┐

│ └──┬────┘│ │

┌──────┴┐ ┌─┴──┐┌─┴──┐┌─┴──┐

│生长及菌落观察│ │染色镜检││生化试验││菌株保存│

└──────┬┘ └─┬──┘└─┬──┘└┬───┘

└───────┼─────┴────┘

┌──┴─┐

│ 报告 │

└────┘

6 操作步骤

6.1 菌数测定

以无菌操作将检样25g(mL)(按GB4789.2测定),用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做

成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL,接种在两个选择性培养基—甘露醇卵

黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上,用L形棒涂布于整个表面,置36±1℃温箱培养

12～20h后选取适当菌落数的平板进行计数,蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌

落为粉红色(表示不发酵甘露醇)周围有粉红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。计算

后,从中挑取5个此种菌落做证实试验。根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落数计

算出该平板上的菌落数,然后乘其稀释倍数,即得每克(或毫升)样品中所含蜡样

芽胞杆菌数,例如MYP平板的可疑菌落为25个,取5个鉴定,证实为4个,乘上稀释倍

数(如104),再乘上1g(或mL)检样数(取的是0,1mL样)则为:

25×4/5×104×10 = 2×106

6.2 分离培养

取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基(MYP)上,置37℃培养12～20h,挑取

可疑的蜡样芽胞杆菌菌落(见6.1)接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养,然后做证实试验。

6.3 证实试验

6.3.1 形态观察

本菌为革兰氏阳性大杆菌,宽度在1μm或1μm以上,芽胞呈卵圆形,不突出菌体,多位于菌体中央或稍偏于一端。

6.3.2 培养特性

本菌在肉汤中生长混浊,常微有菌膜或壁环,振摇易乳化;在普通琼脂平板上生成的

菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状,边缘不齐。

6.3.3 生化性状及生化分型

6.3.3.1 生化性状

本菌有动力;能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶;过氧氢酶试验阳性;溶血;不发酵甘露醇

和木糖;常能液化明胶和使硝酸盐还原;在厌氧条件下能发酵葡萄糖。

6.3.3.2 生化分型

蜡样芽胞杆菌可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶

液化性状的试验,将该菌分成不同的型别,见表1。

表1 蜡样芽胞杆菌生化分型

┌──┬───────────────────────────┐

│型别│ 生化试验 │

│ ├──────┬─────┬────┬────┬────┤

│ │柠檬酸盐利用│硝酸盐还原│淀粉水解│V－P反应│明胶液化│

├──┼──────┼─────┼────┼────┼────┤

│ 1 │ ＋ │ ＋ │ ＋ │ ＋ │ ＋ │

│ 2 │ － │ ＋ │ ＋ │ ＋ │ ＋ │

│ 3 │ ＋ │ ＋ │－ │ ＋ │ ＋ │

│ 4 │ － │ － │ ＋ │ ＋ │ + │

│ 5 │ － │ － │ － │ ＋ │ + │

│ 6 │ ＋ │ － │ ＋ │ ＋ │ + │

│ 7 │ ＋ │ － │ － │ ＋ │ + │

│ 8 │ － │ ＋ │ － │＋ │ + │

│ 9 │ － │ ＋ │ － │ － │ + │

│ 10 │ － │ ＋ │＋ │ － │ + │

│ 11 │ ＋ │ ＋ │ ＋ │ － │ + │

│ 12 │ ＋ │ ＋ │ － │ － │ + │

│13 │ － │ － │ ＋ │ － │ + │

│14 │ ＋ │ － │ － │ － │ + │

│15 │ ＋ │ － │ ＋ │ － │ + │

└──┴──────┴─────┴────┴────┴────┘

6.3.4 与类似菌鉴别

本菌与其他类似菌的鉴别见表2。

表2 蜡样芽胞杆菌与其他类似菌的鉴别

┌─────┬──────┬──────┬───────┬──────┬──────┐

│项目 │巨大芽胞杆菌│蜡样芽胞杆茵│苏云金芽胞杆茵│蕈状芽胞杆菌│炭疽芽胞杆菌│

├─────┼──────┼──────┼───────┼──────┼──────┤

│过氧化氢酶│ ＋ │ ＋ │ ＋ │ ＋ │ ＋ │

│ 动力 │ ± │ ± │ ± │ － │ － │

│硝酸盐还原│ － │ ＋ │ ＋ │ ＋ │ ＋ │

└─────┴──────┴──────┴───────┴──────┴──────┘

续表2