中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.6-94
致 泻 大 肠 埃 希 氏 菌 检 验 代替GB 4789.6-84
Microbiological examination of food hygiene
Examination of diarrheogenic Escherichia coli
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1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。
本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验。
2 引用标准
GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂
3 设备和材料
3.1 天平:称取检样用。
3.2 均质器或乳钵。
3.3 温箱:36±1℃,42℃。
3.4 水浴:100℃65～68℃,50℃。
3.5 显微镜。
3.6 离心机。
3.7 酶标仪。
3.8 细菌浓度比浊管:Mac Farland 3号。
3.9 灭菌广口瓶:500mL。
3.10 灭菌三角烧瓶:500mL,250mL。
3.11 灭菌平皿:90mm×15mm。
3.12 灭菌试管:10mm×175mm。
3.13 菌吸管:1mL,5mL。
3.14 橡皮乳头。
3.15 载玻片。
3.16 酒精灯。
3.17 灭菌金属匙或玻璃棒。
3.18 接种棒,镍铬丝。
3.19 试管架,试管篓。
3.20 冰箱。
3.21 注射器:0.25mL,连接内径为1mm塑料小管一段。
3.22 灭菌的刀子、剪子、镊子。
3.23 小白鼠:1～4日龄。
3.24 硝酸纤维素滤膜150mm×50mm, 0.45μm。临用时切成两张,每张75mm×50mm,
用铅笔划格,每格6mm×6mm,每行10格,分6行。灭菌备用。
4 培养基和试剂
4.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
4.2 营养肉汤:按GB 4789.28中4.8规定。
4.3 肠道菌增菌肉汤:按GB 4789.28中4.18规定。
4.4 麦康凯琼脂:按GB 4789.28中4.24规定。
4.5 伊红美蓝琼脂(EMB):按GB 4789.28中4.25规定。
4.6 三糖铁琼脂(TSI):按GB 4789.28中4.26,4.27规定。
4.7 克氏双糖铁琼脂(KI):按GB 4789.28中4.28,4.29规定。
4.8 糖发酵管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇):按GB 4789.28中3.2规定。
4.9 赖氨酸脱羧酶试验培养基:按GB 4789.28中3.12规定。
4.10 尿素琼脂(pH7.2):按GB4 789.28中3.15规定。
4.11 氰化钾(KCN)培养基:按GB 4789.28中3.16规定。
4.12 蛋白胨水、靛基质试剂:按GB 4789.28中3.13规定。
4.13 半固体琼脂:按GB 4789.28中4.30规定。
4.14 Honda氏产毒肉汤:按GB 4789.28中4.34规定。
4.15 Elek氏培养基:按GB 4789.28中4.35规定。
4.16 氧化酶试剂:按GB 4789.28中3.18规定。
4.17 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
4.18 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠
埃 希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。
4.19 产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒。
4.20 产肠毒素LT和ST大肠埃希菌标准菌株。
4.21 抗LT抗毒素。
4.22 多粘菌素B纸片:300IU, 16mm。
4.23 0.1%硫柳汞溶液。
4.24 2%伊文思蓝溶液。
5 检验程序
致泻大肠埃希氏菌检验程序如下:
┌─────┐
│ 检 样 │
└──┬──┘
┌───┼─────────┐
┌───────┴┐┌─┴───────┐┌┴───────┐
│测大肠菌群MPN ││污染严重的检样匀液││25g营养肉汤225ml│
└────┬───┘└────┬────┘└───┬────┘
┌────┴─────┐┌──┴──┐ ┌────┴──┐
│乳糖发酵阳性的发酵管├┤麦康凯EMB├─┤肠道菌增菌肉汤│
└──────────┘└──┬──┘ └───────┘
│
┌───────┴──────┐
│乳糖发酵或不发酵的菌落3-5个│
│ 氧化酶-,革兰氏阴性杆菌 │
└───────┬──────┘
┌─────┴─────┐
│ TSI,靛基质,PH7.2尿素│
│ KCN.赖氨酸.动力 │
└───┬──────┬┘
┌─────┴─┐ ┌──┴───┐
│TSI底层+,H2S-│ │非如左述的 │
│KCN-,尿素- │ │各种反应结果│
└────┬──┘ └─────┬┘
┌─┴───┐ └┐
│血清学试验│ │
└─┬───┘ │
┌─────┬──┴──┬───┐ │
┌──┴┐┌───┴──┐┌─┴─┐┌┴───┐│
│ ETEC+││EPEC+或 ││EIEC+││非如左述││
└─┬─┘│EHEC+(O157) │└┬──┘│的结果 ││
│ └┬─────┘ │ └─┬──┘│
│ │ │ │ │
┌─┴──┐│┌──────┴──┐ │ │
│肠毒素+ │││ 赖氨酸-,靛基质+,│ │ │
├────┘│└──────┬──┘ │ │
│┌────┴──────┐│ │ │
││肠道致病大肠埃希氏菌或││ │ │
││肠道出血性大肠埃希氏菌││ │ │
│└─────┬─────┘│ │ │
├─────┐│ ┌────┴─┐┌──┴──┐├─────┐
│产肠毒素大││ │肠道侵袭性 ││非致泄大肠││非大肠埃希│
│肠埃希氏菌││ │大肠埃希氏菌││埃希氏菌 ││氏菌 │
└──┬──┘│ └─┬────┘└─┬───┘└─┬───┘
└───┴───┼───────┴──────┘
┌──┴──┐
│ 报告 │
└─────┘
6 操作步骤
6.1 增菌
样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外,一般不冷藏。
以无菌手续称取检样25g,加在225mL营养肉汤中,以均质器打碎1min或用乳钵加
灭菌砂磨碎。取出适量,接种乳糖胆盐培养基,以测定大肠菌群MPN,其余的移入
500mL广口瓶内,于36±1℃培养6h。挑取1环,接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内,
于42℃培养18h。
6.2 分离
将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝
琼脂平板;污染严重的检样,可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板,于
36±1℃培养18～24h,观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落,同时也要注意乳糖
不发酵和迟缓发酵的菌落。
6.3 生化试验
6.3.1 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼
脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉
汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。
6.3.2 TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸,H2S阴性,KCN阴性和尿素阴性的培养物为大
肠埃希氏菌。TSI底层不产酸,或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物,均非大
肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。
6.4 血清学试验
6.4.1 假定试验:挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物,用致病性大肠埃
希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠
埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时,再与该多价血
清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表1。如与
某一个单价O血清呈现强凝集反应,即为假定试验阳性。
表1 致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群
┌─────────┬───────────────────────────┐
│大肠埃希氏菌的种类│ 所包括的O抗原群 │
├─────────┼───────────────────────────┤
│ EPEC │O26 O55 O86 O111ab Ol14 O119 O125AC │
│ │O127 O128AB O142 O158 │
├─────────┼───────────────────────────┤
│ EHEC │O157 │
├─────────┼───────────────────────────┤
│ │O28ac 029 Ol12ac O115 0124 O135 O136 │
│ EIEC │O143 O144 O152 O164 O167 │
├─────────┼───────────────────────────┤
│ │O6 06 O11 O15 O20 025 O27 063 O78 O85 0114 │
│ ETEC │0ll5 0126 0128ac O148 O149 O159 O166 0167 │
└─────────┴───────────────────────────┘
6.5 肠毒素试验
6.5.1 酶联免疫吸附试验检测LT和ST。
6.5.1.1 产毒培养:将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基
内,37℃振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL,于37℃1h,离心
4 000r/min15min,分离上清液,加入0.1%硫柳汞0.05mL,于4℃保存待用。
6.5.1.2 LT 检测方法(双抗体夹心法):(1)包被:先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管,加入包被液0.5mL,混匀后全部吸出于3.6mL包被
液中混匀,以每孔100μL 量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中,第一孔留空作对照,于
4℃冰箱湿盒中过夜。(2)洗板:将板中溶液甩去,用洗涤液Ⅰ洗3次,甩尽液体,翻转反
应板,在吸水纸上拍打,去尽孔中残留液体。(3)封闭:每孔加100μL封闭液,于37℃水
浴中1h。(4)洗板:用洗涤液Ⅱ洗 3次,操作同上。(5)加样本:每孔分别加各种试验菌株
产毒培养液100μL,37℃水浴中1h。(6)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3 次,操作同上。(7)加酶标抗体:先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液,混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀,
每孔加100μL,37℃水浴中1h。(8)洗板:用洗涤液Ⅱ洗 3次,操作同上。(9)酶底物反
应:每孔(包括第一孔)各加基质液100μL,室温下避光作用5～10min,加入终止
液50μL。(10)结果判定:以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值,待测标本OD
值大于阴性对照3倍以上为阳性,目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。
6.5.1.3 ST检测方法(抗原竞争法):(1)包被:先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液,
混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀,以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯软反应
板中。加液后轻轻敲板,使液体布满孔底。第一孔留空作对照,置4℃冰箱湿盒中
过夜。(2)洗板:用洗涤液Ⅰ 洗 3次,操作同上。(3)封闭:每孔加100μL封闭液,37℃
水浴1h。(4)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(5)加样本及ST单克隆抗体:每孔分
别加各试验菌株产毒培养液50μL,稀释的ST单克隆抗体50μL(先在ST单克隆抗体
管中加0.5mL稀释液,混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中,混匀备用),37℃水浴1h。
(6)洗板;用洗涤液Ⅱ洗 3次,操作同上。(7)加酶标记兔抗鼠Ig复合物:先在酶标记兔
抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液,混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀,每孔
加100μL,37℃水浴 1h。(8)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(9)酶底物反应:每
孔(包括第一孔)各加基质液100μL,室温下避光5～10min,再加入终止液50μL。
(10)结果判定:以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值:
阴性对照OD值-待测样本OD值
------------------------------------------------------------×100%≥50% 为阳性
阴性对照OD值
目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。
6.5.2 双向琼脂扩散试验检测LT:将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。
以同样操作,共做两份,于36℃培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B 纸片,于
36℃经5～6h,使肠毒素渗入琼脂中,在五点环形菌苔各5mm处的中央,挖一个直径
4mm的圆孔,并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30μL,用已知
产LT和不产毒菌株作对照,于36℃经15～20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间
出现白色沉淀带者为阳性,无沉淀带者为阴性。
6.5.3 乳鼠罐胃试验检测ST
将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内,于36℃培养24h,以3 000r/min离心30min,
取上清液经薄膜滤器过滤,加热60℃ 30min,每1mL滤液内加入2%伊文思蓝溶液
0.02mL。将此滤液用塑料小管注入1～4日龄的乳鼠胃内0.1mL,同时接种3～4只
,禁食3～4h后用三氯甲烷麻醉,取出全部肠管,称量肠管(包括积液)重量及剩余体
重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性,0.07～0.09为可疑。
6.6 结果报告
综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。
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附加说明:
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由江西省卫生防疫站负责起草。
本标准主要起草人何晓青
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
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中华人民共和国卫生部1994-03-18批准 1994-09-01实施
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